Reduza a quantidade do meu modelo.Aumente a temperatura de recozimento.Use PCR de aterrissagem.Reduza o número de telefone dos ciclos de PCR.Redesenhando os primers.Use primers aninhados.Reforçar o papel do produto.
Reduza o número do modelo.Aumente a temperatura de recozimento.Use PCR de aterrissagem.Reduzir o número principal de ciclos de PCR em humanos.Remodelação da fundação.Use primers de substâncias compostas.Reforce o produto novamente.
Por que estou ficando manchado após a PCR?
Como regra geral, não deve haver manchas do produto de PCR devido ao tipo de concentração mais alta de DNA modelo. Uma grande quantidade de DNA molde geralmente resultará em bandas bastante espessas no produto gel, a menos que todo o seu DNA esteja degradado ou o RNA certamente não esteja de acordo com as especificações. Higiene. Contaminação de DNA, RNA no design de DNA, alta concentração de DNA na resposta de PCR podem causar manchas.
Por que recebo esfregaços de PCR?
ID de perguntas frequentes -87
Reveja outros dos seguintes fatores que podem contribuir para ajudá-lo a usar loções de PCR revestidas não específicas, além de sugestões sobre como evitá-las:
Executar modelo muito longe
Verifique o foco no modelo de abertura. Faça diluições em série de Nucleic Acid Format da solução estoque. Realize a PCR definindo essas diluições em série.
PC lento?
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Transferência de contaminação
Se todos os controles de PCR negativos (sem DNA modelo) mostrarem um suplemento dietético importante ou swab de PCR, troque vários reagentes. Use pontas de pipeta descartáveis com filtros hidrofóbicos para ajudar a minimizar a contaminação cruzada. Coloque todas as misturas de reação em uma boa zona sólida separada, que, por sua vez, não pode ser para preparação de DNA ou análise de sistema de PCR.
Alta enzima
Se a polimerase de DNA HotStarTaq ou Taq também for usada, use 2 unidades associadas a 5 por 100 µl de mistura de reação.
Como você pode eliminar completamente um esfregaço na PCR?
“Se a divisão de PCR parecer um esfregaço, você pode ter para aumentar as condições de recozimento ou diminuir os níveis de magnésio (se o cliente adicionou o próprio mineral magnésio e ainda não estava na mistura exata). Ele provavelmente vai adicionar um modelo como deixe-me dizer-lhe. “Eu sugeriria o uso de géis recém-preparados junto com a execução deles em tampão de corrida recém-preparado.
Muito poucos ciclos de PCR
Reduza o número de fases em etapas de 3 ciclos.
Detecção sub-ótima de Mg2+
Realize PCR com valores de Mg2+ variáveis de última hora de 1,5 a 5,0 milímetros (em incrementos de 0,5 mm) da solução de MgCl2 35 mM fornecida (consulte a tabela abaixo):
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Força final de Mg2+ na reação (mM)
1,5
2.0
2,5
3.0
3,5
4.0
4.5
5.0
Maioria necessária de 26 mM MgCl2 por grupamento de reação (µl)
0
2
4
6
8
10
12
14
Primário abaixo do ideal ou degradado
Repita a PCR com diferentes concentrações de primer de tinta de 0,1 a 0,5 µM por 101 (em incrementos de 0,1 µM). Especialmente ao realizar PCR de alta sensibilidade, procure uma possível degradação do 101 usando um gel de poliacrilamida desnaturante.
Como você soluciona um problema de 101 dímeros?
aumentar a temperatura de recozimento.Aumente o tempo/temperatura associado à desnaturação do modelo.Reduza a concentração do 101 (10 pmol podem funcionar)Use alguma forma de intensificador de PCR, como DMSO.Olhe para o seu modelo.Use tags de qualidade otimistas.
O design do primer não é ideal para todos
Como você conserta um dímero de primer?
Aumente a temperatura de recozimento.Aumente o tempo/temperatura para combinação com a desnaturação do modelo.Diminua a quantidade de primer (10 pmol se encaixam automaticamente)Use um ativador de PCR como DMSO.Olhe para o seu modelo.Use etiquetas de qualidade.
CheckPersonalize seu recurso e crie primers originais
Para obter mais informações sobre como reunir soluções de PCR, consulte as seções do apêndice relacionadas às instruções de Taq PCR e HotStarTaq DNA Polymerase, bem como nosso folheto abrangente Fatores críticos de sucesso para PCR.
Possíveis causas
Recomendações
Modelos de DNA
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Integridade ruim
Minimizando quebras e quebras de DNA durante a extração. Se benéfico, avalie o DNA modelo por eletroforese em gel de integridade.
Armazene o DNA energizante em água molecular ou obstáculo TE 8-10 (ph.0) para evitar a degradação por nucleases.
Baixa pureza
Estrita conformidade com as recomendações do fabricante ao usar o kit de limpeza para DNA Modelo de extração. Consulte o guia de acerto e o guia de solução de problemas para mitigar o DNA de baixa qualidade benéfica.
Certifique-se de que, ao usar produtos químicos e/ou verifique os protocolos de purificação de DNA enzimático conforme necessário, certifique-se de que definitivamente não haverá inibidores de PCR residuais, como fenol, l-EDTA e, além disso, proteinase K.
Repurifique o DNA com 70% de etanol ou pode ser precipitado e purificar o DNA para remover o sal oculto ou (por exemplo, íons, por exemplo, K+ , Na+, etc.) que inibem muitas DNA polimerases.
Escolha DNA polimerases de alta processabilidade que exibem alta tolerância em comparação com elegantes inibidores de PCR que estão entre sangue, solo, tecidos de localização , etc.
Não é suficiente
Verifique alguma quantidade de DNA injetado e aumente os dólares quantidade, se necessário.
Selecione as DNA polimerases com a maior sensibilidade de amplificação.
Aumente a quantidade total, se necessário, os ciclos de PCR.
Destinos complexos (por exemplo, ricos em GC ou simples ex tra estruturas)
Escolha DNA polimerases com extraordinária processabilidade que exibem alta afinidade para métodos de DNA e melhor x é adaptado para aumentar alvos incômodos. Use um aditivo de PCR ou co-solvente no mercado para ajudar em sequências ricas em DNA e GC. Capacidade de desnaturar DNA e estruturas secundárias.
Aumente o tempo de desnaturação e/ou separe os modelos da web do DNA de fita dupla em uma maneira amigável ao clima.
Alvos longos
Verifique o comprimento de som permitido do toda a genética da polimerase selecionada. Use polimerases de DNA geradas especialmente para PCRs incrivelmente longos.
Escolha polimerases de DNA com grande capacidade de processamento, pois elas podem amplificar alvos longos em pouco tempo.
Reduzir a temperatura de hibridização e o alongamento ajuda a encontrar nos primers , ligação enzimática e estabilidade térmica.
Aumento no tempo de alongamento total dependendo do comprimento do amplicon.
Primers
Projeto do problema
Verifique o básico da unidade. Use ferramentas de design on-line apropriadas do governo federal,
certifique-se de que cada um dos primers corresponda ao alvo de interesse.
Certifique-se de que os primers parecem ser complementares a todas as fitas corretas do DNA do endereço.
Primers antigos
Os primers são divididos em alíquotas e mantidos adequadamente geralmente após a ressuspensão.
Restaure alíquotas de primers frescas ou realize novas se forem necessários primers.
< td>Não é suficiente
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Otimize os valores de primer (geralmente na faixa de 0,1-1 µM cada).
Para PCR muito mais longa , e para PCR com primers degenerados, comece com uma concentração mínima de 0,5 μM.
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Outra reação a componentes
DNA polimerase inadequada
Uso de DNA de inicialização a quente para detectar degradação aparente de primers d enquanto corrige a atividade esportiva de 3’≤5′ DNA polimerase exonuclease. As DNA polimerases de inicialização a quente também aumentam nosso rendimento de PCRs selecionados com produtos que removem a amplificação não específica.
Você também pode programar a PCR no gelo ou adicionar a DNA polimerase mais recente à nossa própria mistura de reação.< /li>
Conjunto inadequado de DNA polimerases
Escolha DNA polimerases com excelente sensibilidade para amplificação.
Escolha DNA polimerases com excelente sensibilidade para amplificação.
li>< li> Reconsidere Use a dose recomendada de DNA polimerase em PCRtrends e otimize se necessário.
Aumente os níveis de DNA polimerase se a mistura de reação cobrir uma alta concentração de um produto químico (por exemplo, DMSO, formamida) ou amostra de inibidores de qualquer fonte.
Concentração insuficiente de Mg2+
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Otimizar gerenciamento
Por que estou recebendo cobertura após a PCR?
Contaminação de DNA, RNA em amostras de DNA, concentrações aumentadas de DNA na reação de PCR podem causar manchas. O swab de DNA geralmente é inflamado em plantas devido ao alto nível de sensibilização ao DNA modelo. Portanto, revise o modelo após ter sido dimensionado deprimido I.
“Se os produtos de PCR aparecerem como listras, sua organização pode precisar aumentar a temperatura de recozimento ou, alternativamente, diminuir o Mg (se você adicionou Mg pessoal, ele ainda não estava na mistura). Você também deve adicionar muitos modelos.” Eu sugiro usar massa recém-feita e quebrar uma fechadura de barril recém-feita.
