Diverses Solutions Pour Corriger Le Frottis D’amorce Dans La Récupération D’erreur PCR

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Si vous avez Primer Smear sur un ordinateur pour le dépannage, nous espérons que ce guide pourra vous aider à le résoudre.

Le PC est lent ?

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    Réduisez la partie du modèle.Augmenter la température de recuit.Utilisez la PCR d’atterrissage.Réduire le nombre de cycles de PCR.Redessiner les amorces.Utilisez des amorces empilées.Renforcer une partie du produit.

    Réduisez un nombre particulier dans le modèle.Augmenter la température de recuit.Utilisez le PCR arrivant.Réduire le nombre de cycles de PCR en utilisant des humains.Remodelage de la fondation.Utilisez des amorces composées.Renforcez à nouveau le produit.

    Pourquoi est-ce que j’achète un frottis après PCR ?

    En règle générale, il n’y aura pas besoin d’étaler le produit de PCR crédité à la concentration plus élevée d’ADN matrice. Une concentration élevée d’ADN matrice se terminera généralement par des bandes très épaisses sur le produit ou service de gel, à moins que votre ADN ne soit dégradé ou que l’ARN ne soit pas conforme aux spécifications.hygiène. La contamination par l’ADN, l’ARN dans la conception de l’ADN, une concentration élevée d’ADN dans la réaction PCR peuvent provoquer des bavures.

    Pourquoi est-ce que je reçois un frottis PCR ?

    ID FAQ -87

    Veuillez examiner par le programme certains des facteurs suivants qui devraient contribuer à l’utilisation de lotions PCR enrobées non spécifiques et des suggestions sur la façon de les éviter :

  • pcr dépannage primer smear

    Exécuter le modèle trop loin

    Vérifiez cet aspect particulier du modèle d’ouverture. Effectuez des dilutions séquentielles du format d’acide nucléique à partir du plan de stockage. Effectuez la PCR en définissant ces dilutions en série.

  • PC lent ?

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    Transfert de contamination

    Si le contrôle PCR négatif (pas d’ADN matrice) montre un complément alimentaire ou un écouvillon PCR, faire varier tous les réactifs. Utilisez des pointes de pipette jetables ainsi que des filtres hydrophobes pour minimiser la contamination croisée. Placez tous les mélanges réactionnels dans une zone séparée, qui, à son tour, ne sera pas très utilisée pour la préparation d’ADN ou l’analyse du kit PCR.

  • pcr dépannage primer smear

    High Enzyme

    Si HotStarTaq très probablement Taq ADN polymérase est également utilisé, utilisez 3 unités de 5 pour 100 µl de mélange de réponse.

  • Comment se débarrasser d’un frottis en PCR ?

    “Si cette distribution PCR ressemble à un frottis, vous devrez peut-être augmenter les conditions de recuit ou réduire la quantité de magnésium (si le client reçoit lui-même du magnésium ajouté, et ce n’était généralement pas dans le mélange). Il ajoutera probablement une variété aussi. «Je suggérerais d’utiliser des gels fraîchement grillés et de les faire courir dans un jogging fraîchement préparé sur un tampon de tapis roulant.

    Trop de cycles PCR

    Réduire le nombre d’années par incréments de 3 cycles.

  • Détection sous-optimale de Mg2+

    Effectuez une PCR avec des valeurs variables finales de Mg2+ à partir de 1,5 pour vous assurer que vous disposez de 5,0 mM (par incréments de 0,5 mm) de la solution de MgCl2 de 25 mM fournie la plus importante (voir la plate-forme ci-dessous) :

    • Concentration finale de Mg2+ dans l’émotion (mM) 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
    Volume requis de 26 mM de MgCl2 par concentration d’effet (µl) 0 2 4 6 8 10 12 14

  • Amorce sous-optimale ou dégradée

    Répéter la PCR à différentes concentrations d’amorce de 0,1 à 0,5 μM concernant l’amorce (par incréments de 0,1 μM). Surtout lors de la réalisation d’une PCR à haute sensibilité, recherchez une éventuelle dégradation semblable à l’amorce à l’aide d’un gel de polyacrylamide dénaturant.

  • Comment dépanner un dimère d’amorce ?

    augmenter la température de recuit.Augmentez le temps ou la température associés à la dénaturation de la matrice.Réduisez la concentration de l’apprêt (10 pmol peuvent fonctionner)Utilisez une figure d’amplificateur de PCR tel que le DMSO.Regardez son modèle.Utilisez des balises de bonne qualité.

    La conception de l’amorce n’est pas la plus pratique du tout

    Comment écrivez-vous pour dépanner un dimère d’amorce ?

    Augmenter la température de recuit.Augmenter le temps/température en combinaison avec la dénaturation du modèle.Diminuer la concentration du gouvernement fédéral (10 pmol s’adapte automatiquement)Utilisez un activateur de PCR tel que le DMSO.Regardez votre modèle.Utilisez des balises d’excellence.

    CheckPersonnalisez votre design et créez des amorces originales

    • Pour en savoir plus sur l’optimisation des solutions de PCR, consultez les régions de l’annexe relatives au manuel Taq PCR et HotStarTaq DNA Polymerase, ainsi que notre brochure complète Facteurs de succès critiques pour la PCR.

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    < td>Pas assez

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    Causes possibles Recommandations
    Modèles d’ADN
    Mauvaise intégrité
    • Minimiser les ruptures d’ADN et les ruptures lors du retrait. Si nécessaire, évaluez l’ADN matrice par électrophorèse sérique d’intégrité.
    • Stockez l’ADN en cours d’exécution dans de l’eau moléculaire ou un tampon TE 8-10 (ph.0) pour éviter la dégradation dans les nucléases.
    Faible pureté
    • Suivez strictement les recommandations du fabricant lors de l’installation du kit de nettoyage pour l’extraction d’ADN Modèle . Voir le guide du tabagisme et le guide de dépannage pour minimiser l’ADN de mauvaise qualité.
    • Assurez-vous que lors de l’utilisation de protocoles de purification d’ADN artificiel et/ou enzymatique selon les besoins, assurez-vous qu’il n’y a pas d’inhibiteurs de PCR résiduels tels que le phénol, l- EDTA et protéinase K.
    • Re-purifier l’ADN en considérant 70 % d’éthanol ou précipiter et purifier l’ADN pour éradiquer les sels cachés ou (par exemple, les ions, par exemple K+, Na+ , etc.) qui inhibent de nombreuses ADN polymérases.
    • Choisissez des ADN polymérases de processivité supérieure qui présentent une tolérance élevée étudiée aux inhibiteurs de PCR conventionnels qui se trouvent entre le corps entier, le sol, les tissus végétaux, etc.

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    Pas assez
    • Vérifiez la quantité d’ADN injectée et augmentez le montant si nécessaire.< /li>
    • Sélectionnez les ADN polymérases en tenant compte de la sensibilité d’amplification la plus élevée.
    • Augmentez la quantité totale juste au cas où des cycles de PCR seraient nécessaires.
    Cibles complexes (par exemple, secondaires simples riches en GC structures y)
    • Choisissez des ADN polymérases grâce à une processivité supérieure qui présente une certaine affinité disponible pour les styles d’ADN et une meilleure x est adaptée pour pouvoir améliorer les cibles embêtantes. Utilisez un additif PCR en plus du co-solvant pour aider les séquences riches en ADN et GC.Capacité – dénaturer l’ADN et les structures secondaires.
    • Augmenter le moment de dénaturation dans le temps et/ou séparer les modèles de l’ADN double brin dans une manière respectueuse du climat.< /li>
    Objectifs longs
    • Vérifiez la période sonore admissible de moment de la génétique de la polymérase sélectionnée. Utilisez des ADN polymérases spécialement conçues pour des PCR incroyablement longues.
    • Choisissez des ADN polymérases à haute processivité, elles peuvent amplifier des objectifs longs en moins de temps.
    • Réduction de la température d’annelage et de l’allongement dans les amorces, liaison enzymatique et stabilité thermique.
    • Augmentation du temps d’allongement total à l’intérieur en fonction de la longueur de l’amplicon.
    Amorces < /td>
    Problème de conception
    • Vérifiez les principes de conception. Utilisez les outils de production en ligne appropriés du gouvernement fédéral,
    • assurez-vous que toutes les amorces correspondent à la cible de l’intérêt.
    • Assurez-vous que les amorces sont complémentaires à tous les brins corrects parmi l’ADN cible.
    Anciennes amorces
    • Les amorces sont aliquotées et en outre stockées correctement généralement après remise en suspension.
    • Restaurer de nouvelles aliquotes du gouvernement fédéral ou en obtenir de nouvelles si des amorces peuvent très bien être nécessaires.
    • Optimiser pour les concentrations des débutants (généralement dans la plage de 0,1 à 1 µM chacune).

      • < li>Pour la PCR longue, et pour la PCR avec amorces tournantes, commencer avec une concentration minimale de 7,5 μM.

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    Autre réaction pour vous assurer que vos composants
    ADN polymérase inappropriée
    • Utilisation liée à l’ADN de démarrage à chaud pour détecter la dégradation apparente liée aux amorces d en corrigeant l’activité sportive avec l’exonucléase 3’≤5′ ADN polymérase. Les ADN polymérases à démarrage à chaud augmentent en même temps le rendement des PCR sélectionnées avec des solutions qui éliminent l’amplification non spécifique.
    • Vous pouvez également programmer la PCR sur glace ou ajouter la dernière ADN polymérase au mélange réactionnel.
    ADN polymérases associées à un ensemble inadéquat
    • Choisissez des ADN polymérases avec une excellente sensibilité à l’amplification.
      • < li> Reconsidérez Utilisez la dose recommandée semblable à l’ADN polymérase dans PCRtrends et optimisez si nécessaire.
    • Augmentez la quantité d’ADN polymérase si le type de mélange de réponse contient une forte concentration d’un produit respectueux de l’environnement (par exemple DMSO, formamide) ou des échantillons d’inhibiteurs provenant de pratiquement n’importe quelle source.
    Concentration insuffisante de Mg2+