PCR 오류 복구에서 프라이머 커버링을 수정하는 다양한 방법

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문제 해결을 위해 컴퓨터에 Primer Smear가 있는 경우 이 가이드가 문제를 해결하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.

PC가 느리게 실행되나요?

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    모델의 양을 줄이십시오.어닐링 온도를 높이십시오.착륙 PCR을 사용합니다.PCR 주기 수를 줄입니다.프라이머 다시 그리기.중첩된 프라이머를 사용합니다.사람의 제품의 일부를 강화하십시오.

    템플릿에서 숫자를 줄이십시오.일반적으로 어닐링 온도를 높입니다.착륙 PCR을 사용합니다.인간의 PCR 주기 수를 줄입니다.재단 리모델링.복합 프라이머를 사용하십시오.응용 프로그램을 다시 강화하십시오.

    PCR 후 얼룩이 생기는 이유는 무엇입니까?

    원칙적으로 template DNA의 농도가 더 높기 때문에 이러한 PCR 산물에 번짐이 없어야 합니다. DNA가 변경되거나 RNA가 사양에 맞지 않는 경우를 제외하고, 주형 DNA의 농도가 높으면 일반적으로 젤 제품과 관련된 매우 두꺼운 밴드가 생성됩니다. 위생. DNA 오염, DNA 디자인의 RNA, PCR 반응의 높은 DNA 일치는 번짐을 유발할 수 있습니다.

    PCR 도말을 받는 이유는 무엇입니까?

    FAQ ID -87

    비특이 코팅된 PCR 로션의 사용에 기여할 수 있는 몇 가지 요인과 이를 피하는 방법에 대한 제안 사항을 검토하십시오.

    <문자열><리>
    pcr Troubleshooting primer smear

    배열이 너무 깁니다.

    시작 개념의 초점을 확인하십시오. 스톡 솔루션에서 나오는 핵산 형식의 연속 희석을 확인합니다. 이러한 연속 희석의 대부분을 설정하여 PCR을 수행합니다.

    <리>

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    오염 전이

    음성 PCR 감소(주형 DNA 없음)가 식이보충제와 PCR 면봉으로 표시되면 모든 시약을 교체하십시오. 교차 오염을 최소화하기 위해 소수성 필터가 있는 일회용 피펫 팁을 사용하십시오. 모든 반응 혼합물을 별도의 구역에 배치합니다. 이 구역에서는 DNA 완성 또는 PCR 시스템 분석에 사용할 수 없습니다.

    <리>
    pcr Troubleshooting paint primer smear

    고효소

    HotStarTaq 또는 Taq DNA 중합효소를 추가로 사용하는 경우, 반응 혼합물 1µl당 5개 단위 2개를 사용하십시오.

    <리>

    PCR에서 적용을 어떻게 제거합니까?

    “PCR 분포가 이 얼룩처럼 보이면 자체 어닐링 조건을 높이거나 마그네슘 비타민의 양을 줄여야 할 수 있습니다(고객이 마그네슘을 직접 추가했고 품목이 이미 믹스에 없는 경우). 그는 모델도 추가할 것입니다. “저는 새로 준비된 젤을 사용하고 새로 준비된 러닝 버퍼용으로 사용하는 것이 좋습니다.

    PCR 주기가 너무 많습니다.

    모든 단계 수를 5주기 단위로 줄입니다.

    <리>

    최적 이하의 Mg2+ 검출

    제공된 25mM MgCl2 패키지(아래 표 참조)의 1.5 ~ 5.0mM(0.5mm 증분)에서 최종 가변 Mg2+ 보기로 PCR 수행:

    < /문자열><테이블 가독성 데이터 테이블="1"><본체>

    반응에서 Mg2+의 최종 농도(mM) 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 반응 농도당 26mm MgCl2의 요구 부피(µl) 0 2 4 6 8 10 12 14

    <문자열><리>

    나쁜 프라이머에 대해 차선책 또는 변경

    프라이머당 0.1~0.5µM의 다양한 프라이머 농도로 PCR을 반복합니다(0.1µM 증분). 특히 고감도 PCR시에는 nice denaturing polyacrylamide gel을 이용하여 프라이머의 분해 가능성을 확인하시기 바랍니다.

    <리>

    프라이머 이합체 문제를 어떻게 해결하시겠습니까?

    어닐링 온도를 높입니다.디자인 템플릿 변성과 관련된 시간/온도를 높입니다.프라이머의 농도를 줄입니다(10pmol은 충분히 가능합니다).DMSO와 같은 PCR 인핸서의 일부 형태를 사용합니다.당신의 모델을 보세요.좋은 품질의 태그를 사용하십시오.

    프라이머 종류가 전혀 최적이 아닙니다

    101 이합체 문제를 어떻게 해결합니까?

    어닐링 온도를 높입니다.제조업체 변성과 함께 시간/온도를 높입니다.프라이머 농도 감소(10pmol 즉시 적합)DMSO와 같은 PCR 활성화제를 사용하십시오.모델을 보세요.품질 태그를 사용합니다.

    디자인을 사용자 정의하고 일반 프라이머를 생성하십시오.

    PCR 솔루션 최적화에 대한 자세한 내용은 Taq PCR 및 HotStarTaq DNA 중합효소 매뉴얼과 관련된 부록 섹션과 포괄적인 소책자 Critical Success Factors for PCR을 참조하십시오.

    < td>충분하지 않음 < td> td>

    li>< li> 재검토 권장량의 DNA 중합효소를 PCR 경향에서 사용하고 필요한 경우 최적화합니다.

  • 반응 혼합물에 화학물질에 대한 높은 의식이 포함되어 있으면 DNA 중합효소의 양을 늘립니다( 예: DMSO, 포름아미드) 또는 모든 출처에서 억제제를 확인하세요.

    • < td>

    가능한 원인 권장사항
    DNA 모델
    불량한 무결성
    • 추출 중 파손 외에 DNA 파손을 최소화합니다. 필요한 경우 무결성 겔 전기영동으로 주형 DNA를 평가합니다.
    • 뉴클레아제에 의한 분해를 방지하기 위해 분자수 또는 TE 8-10(ph.0) 완충액 전체에 실행 중인 DNA를 보관합니다.
    저순도
    • DNA 추출용 세척 키트 사용 시 생산자의 권장 사항을 엄격히 준수 템플릿 . 낮은 품질의 DNA를 완화하려면 흡연 가이드 및 문제 해결 가이드를 참조하세요.
    • 화학 물질을 사용하거나 필요에 따라 효소 DNA 정제 규칙을 따르므로 페놀, l-EDTA와 같은 잔류 PCR 억제제가 없는지 확인합니다. 및 proteinase K.
    • 70% 에탄올로 DNA를 다시 정제하거나 DNA를 침전 및 해독하여 숨겨진 염 또는 (예: 이온, 예: K< sup>+, Na+< /sup> 등) 많은 사람들의 DNA 중합효소를 억제합니다.
    • 혈액, 토양, 식물 조직 등 사이에만 존재하는 기존의 PCR 억제제에 비해 높은 내성을 나타내는 고진행성 DNA 중합효소를 선택하십시오.

    < /td>

    부족함
    • 주입된 DNA의 양을 확인하고, 필요합니다.
    • 가장 높은 증폭 감도를 가진 DNA 중합효소를 선택하십시오.
    • 필요한 PCR 주기의 경우 현재 총량을 늘리십시오.
    복잡한 퀘스트(예: GC가 풍부하거나 단순한 보조 구조 res)
    • 매우 높은 DNA 스타일에 대한 친화도를 나타내는 우수한 가공성을 가진 DNA 중합효소를 선택하고 성가신 표적을 향상시키기 위해 더 나은 z가 적용됩니다. GC가 풍부한 염기서열 외에도 DNA를 돕기 위해 모든 PCR 첨가제 또는 공용매를 사용합니다. DNA 및 적법한 구조를 변성하는 능력.
    • 변성 시간을 늘리거나 기후 조건에서 이중 가닥 DNA에서 템플릿을 분리합니다. 친근한 방식.< /li>
    긴 타겟
    • 선택한 중합효소의 현재 허용 가능한 소리 길이 확인 계승. 상당히 긴 PCR을 위해 특별히 설계된 DNA 중합효소를 사용하십시오.
    • 높은 가공성을 가진 DNA 중합효소를 선택하면 긴 표적을 더 짧은 시간에 증폭하는 경우가 많습니다.
    • 어닐링 설정과 신도를 줄이면 프라이머에 도움이 됩니다. , 효소 결합 추가 열 안정성.
    • 앰플리콘 내부 길이에 따라 총 신장 시간 증가.
    입문서 < /td>
    문제 설계
    • 설계의 기본을 확인합니다. 적절한 국가 정부 온라인 설계 도구를 사용하고
    • 모든 프라이머가 관심 대상과 일치하는지 확인합니다.
    • 프라이머가 대상 DNA의 올바른 가닥과 상보적인지 확인합니다.
    오래된 프라이머
    • 프라이머는 재부유 후 분주되고 일반적으로 적절하게 보관되는 것으로 입증되었습니다.< /li>
    • 정원에서 신선한 프라이머 부분표본을 복원하거나 프라이머가 필요한 경우 새 프라이머를 얻습니다.
    • 프라이머 농도를 최적화합니다(일반적으로 각각 0.1-1μM의 쿡탑에서).

      • < li>장시간 PCR의 경우 및 축퇴 프라이머를 사용한 PCR의 경우 최소 농도 0.5μM부터 시작합니다.

    • li>
    구성 요소에 대한 기타 반응
    부적절한 DNA 중합효소
    • hot-start DNA 사용 3’≤5′ DNA 중합효소 엑소뉴클레아제의 활성을 보정하여 프라이머 d의 가시적 분해를 검출합니다. 또한 Hot get go DNA 중합효소는 비특이적 증폭을 제거하는 제품으로 선별된 PCR의 수율을 높입니다.
    • 잠재적으로 얼음 위에서 PCR을 프로그래밍하거나 최신 DNA 중합효소 전체를 반응 혼합물에 추가할 수도 있습니다.< /li>
    부적절한 DNA 중합효소 세트
    • 증폭에 대한 탁월한 감도를 통해 DNA 중합효소를 선택하십시오.
    Mg 농도가 충분하지 않음2+