Уменьшите количество всей модели.Увеличьте температуру отжига.Используйте посадочную ПЦР.Уменьшить количество циклов ПЦР.Перерисовка праймеров.Используйте вложенные праймеры.Укрепите область изделия.
Уменьшите число по всему шаблону.Увеличьте температуру отжига.Используйте посадочную ПЦР.Уменьшить количество циклов ПЦР у людей.Реконструкция фундамента.Используйте праймеры для продукта.Снова укрепите изделие.
Почему после ПЦР у меня получаются правильные результаты мазка?
Как правило, должно быть какое-либо смазывание продукта ПЦР из-за специфически более высокой концентрации матричной ДНК. Высокая централизация матричной ДНК обычно приводит к невероятно толстым полосам на гелевом продукте, если только ваша хорошая ДНК не деградировала или РНК определенно не соответствует гигиеническим требованиям. Загрязнение ДНК, РНК в дизайне ДНК, высокая концентрация ДНК в эффекте ПЦР могут вызвать смазывание.
Почему я получаю мазки ПЦР?
Идентификатор часто задаваемых вопросов -87
Пожалуйста, ознакомьтесь с некоторыми людьми о следующих факторах, которые могут повлиять на использование лосьонов для ПЦР с неспецифическим покрытием, и посоветуйте, как их избежать:
<ул>
Запустить шаблон слишком далеко
Проверьте фокус на открывающемся шаблоне. Сделайте серийные разведения Nucleic Acid Format из маточного раствора. Выполните ПЦР, установив эти серийные разведения.
ПК работает медленно?
ASR Pro — идеальное решение для ремонта вашего ПК! Он не только быстро и безопасно диагностирует и устраняет различные проблемы с Windows, но также повышает производительность системы, оптимизирует память, повышает безопасность и точно настраивает ваш компьютер для максимальной надежности. Так зачем ждать? Начните сегодня!
Перенос контаминации
Если основной отрицательный контроль ПЦР (без матричной ДНК) показывает новую пищевую добавку или мазок ПЦР, замените более или менее все реагенты. Используйте одноразовые наконечники для пипеток с гидрофобными фильтрами, чтобы свести к минимуму перекрестное загрязнение. Поместите все реакционные смеси в фактически отдельную зону, которая, в свою очередь, не может быть рекомендована для подготовки ДНК или системного анализа ПЦР.
High Enzyme
Если также используется HotStarTaq или ДНК-полимераза Taq, используйте 2 единицы, соединенные с 5 единицами, на 100 мкл реакционной смеси.
Как убрать мазок в ПЦР?
«Если деление ПЦР похоже на мазок, у вас может быть, что увеличит условия отжига или уменьшит долю магния (если заказчик сам добавил минерал магния, а его еще не было в смеси человека). Он, вероятно, добавит модель так же тщательно. «Я бы предложил использовать свежеприготовленные гели или запускать их в свежеприготовленном рабочем буфере.
Слишком много циклов ПЦР
Уменьшите количество фаз в партиях по 3 цикла.
Субоптимальное обнаружение Mg2+
Выполните ПЦР с определенными переменными значениями Mg2+ от 1,5 до 5,0 миллиметров (с шагом 0,5 мм) поставляемого раствора MgCl2 с концентрацией 26 мМ (см. таблицу ниже):
<таблица readabilitydatatable="1"><тело>
Окончательное правильное значение Mg2+ в реакции (мМ)
1,5
<тд>2.0
2.5
<тд>3.0<тд>3.5<тд>4.0<тд>4.5
5.0
Необходимо большое количество 26 мМ MgCl2 на количество реакции (мкл)
<тд>0
2
<тд>4<тд>6
8
<тд>10
12
14
<ул>
Субоптимальный или деградировавший праймер
Повторите ПЦР с различными концентрациями 101 от 0,1 до 0,5 мкМ в зависимости от федерального правительства (с шагом 0,1 мкМ). Особенно при проведении высокочувствительной ПЦР ищите возможную деградацию федерального правительства с помощью денатурирующего полиакриламидного геля.
Как устранить неполадки, связанные с димером федерального правительства?
повысить температуру отжига.Увеличьте время/температуру, связанные с денатурацией шаблона.Уменьшите концентрацию федерального правительства (может сработать 10 пмоль)Используйте какую-либо форму усилителя ПЦР, например ДМСО.Посмотрите на свою модель.Используйте теги достойного качества.
Дизайн праймера не всегда оптимален
Как исправить димер праймера?
Увеличьте температуру отжига.Увеличивайте время/температуру в сочетании с денатурацией модели.Уменьшить узнаваемость праймера (автоматически подходит 10 пмоль)Используйте активатор ПЦР, такой как ДМСО.Посмотрите на свою модель.Используйте теги качества.
ПроверитьНастройте свой вид и создайте оригинальные праймеры
Дополнительную информацию об увеличении количества растворов для ПЦР см. в разделах приложения, посвященных непосредственному использованию Taq PCR и HotStarTaq DNA Polymerase, а также в нашем всеобъемлющем буклете Critical Success Factors for PCR.
Возможные причины
Рекомендации
Модели ДНК
Плохая целостность
Сведение к минимуму разрывов ДНК и разрывов во время экстракции. Если возможно, оцените ДНК-матрицу с помощью электрофореза в геле целостности.
Храните спринтерскую ДНК в молекулярной воде или препятствии TE 8-10 (ph.0) для предотвращения деградации нуклеазами.
Низкая чистота
Строго соблюдайте рекомендации производителя при использовании набора для удаления ДНК Шаблон извлечения. См. руководство по курению табака и руководство по устранению неполадок, чтобы смягчить низкостандартную ДНК.
Убедитесь, что при использовании химических и/или соблюдайте протоколы ферментативной очистки ДНК по мере необходимости, убедитесь, что, вероятно, отсутствуют или остаются ингибиторы ПЦР, такие как фенол, l- ЭДТА, кроме того, протеиназа К.
Повторно очистить ДНК с помощью 70% этанола, осадить и очистить ДНК, чтобы удалить скрытую соль или (например, ионы, например K+, Na+ и т. д.), которые ингибируют многие ДНК-полимеразы.
Выберите высокопроцессивные ДНК-полимеразы, которые демонстрируют высокую толерантность по сравнению с ингибиторами ПЦР, которые находятся между кровью, почвой, тканями ваших семян, и т. д.
< /td>
Недостаточно
Проверьте конкретное количество вводимой ДНК и увеличьте количество, если необходимо.
Выберите ДНК-полимеразы с пиковой чувствительностью амплификации.
Увеличьте общее количество, если необходимо Циклы ПЦР.
Сложные цели (например, GC-богатые или простые легитимные структуры)
Выберите ДНК-полимеразы с явной процессивностью, которые демонстрируют высокое сродство к одежде ДНК и лучше приспособлены для усиления раздражающих мишеней. Используйте добавку или сорастворитель для ПЦР, который может помочь ДНК и GC-богатым последовательностям. Способность денатурировать ДНК и вторичные структуры.
Увеличить время денатурации и/или отделить сеть от двухцепочечной ДНК в климате. дружеской манере.
Длинные цели
Проверьте допустимую длину звука большинства выбранных генетика полимераз. Используйте ДНК-полимеразы, специально предназначенные для невероятно длинных ПЦР.
Выбирайте ДНК-полимеразы с более высокой процессивностью, они могут амплифицировать длинные мишени за меньшее время.
Снижение температуры отжига и удлинения помогает последним праймерам , связывание ферментов и термостабильность.
Увеличение времени полной элонгации в зависимости от длины ампликона.
Учебники
Проектирование задач
Изучите основы . Используйте соответствующие онлайн-инструменты федерального правительства,
убедитесь, что все праймеры соответствуют интересующей цели.
Убедитесь, что праймеры обычно комплементарны всем правильным цепям ДНК жертвы.
Старые праймеры
Праймеры обычно делят на аликвоты и хранят надлежащим образом после ресуспендирования.
Восстановите аликвоты свежих праймеров или получите новые, если праймеры необходимы.
< td>Не более чем достаточно
< td> td>
Оптимизировать концентрации праймеров mit (обычно в диапазоне 0,1–1 мкМ каждый).
< li>Для растянутой ПЦР и для ПЦР с вырожденными праймерами начните с минимальной концентрации 0,5 мкМ.
li>
Другая реакция на компоненты
Неподходящая ДНК-полимераза
Использование ДНК с горячим стартом для обнаружения явная деградация праймеров d при использовании корректирующей активность экзонуклеазы ДНК-полимеразы 3’≤5′. ДНК-полимеразы с горячим стартом также увеличивают фактический выход выбранных ПЦР за счет продуктов, облегчающих неспецифическую амплификацию.
Вы также можете запрограммировать ПЦР на близзардах или добавить новейшую ДНК-полимеразу в точную реакционную смесь.
Недостаточный набор ДНК-полимераз
Выберите для амплификации ДНК-полимеразы с превосходной чувствительностью.
Пересмотреть использование рекомендуемой дозы ДНК-полимеразы в тенденциях ПЦР и оптимизировать ее при необходимости.
Увеличить количество ДНК-полимеразы в долларах, если реакционная смесь будет иметь высокую концентрацию химического вещества (например, ДМСО, формамид) или образцы ингибиторов из любого источника.
Недостаточная концентрация Mg2+
< td>< ul>
Оптимизировать Mg
Почему я получаю покрытие после PCR?
Загрязнение ДНК, РНК в образцах ДНК, высокие концентрации ДНК в реакции ПЦР должны вызывать смазывание. Мазок ДНК обычно находится в растениях из-за высокого уровня, указывающего на сенсибилизацию к модельной ДНК. Поэтому, пожалуйста, просмотрите модель после того, как она была отмасштабирована прямо I.
«Если продукты ПЦР проявляются в виде полос, нам может потребоваться повысить температуру отжига, чтобы уменьшить Mg (если вы добавляли Mg самостоятельно, его еще не было в смеси). Вы также добавите много шаблонов.» Я бы предложил с помощью свежеприготовленной пасты и взламывания свежевыпущенного замка ствола.
