Reduzieren Sie die Menge jedes unserer Modelle.Erhöhen Sie die Glühtemperatur.Lande-PCR verwenden.Reduzieren Sie die Anzahl der PCR-Zyklen.Neuzeichnen der Primer.Verwenden Sie verschachtelte Primer.Teil aus dem Produkt verstärken.
Reduzieren Sie die Anzahl in der aktuellen Vorlage.Erhöhen Sie die Glühtemperatur.Lande-PCR verwenden.Reduzieren Sie die Anzahl der PCR-Zyklen beim Menschen.Umbau der Stiftung.Verwenden Sie schlechtere Grundierungen.Stärken Sie das Produkt erneut.
Warum bekomme ich nach der PCR Schmierflecken?
Generell sollte wegen der besseren Konzentration an Template-DNA auf eine Beschichtung des PCR-Produktes verzichtet werden. Eine hohe Konzentration verbundener Template-DNA führt normalerweise zu sehr dichten Banden auf dem Gelprodukt, es sei denn, Ihre DNA ist abgebaut oder die RNA entspricht nicht der Spezifikation. Hygiene. DNA-Kontamination, RNA in DNA-Form, hohe DNA-Konzentration in der PCR-Reaktion kann durchaus zu Verschmierungen führen.
Warum erhalte ich PCR-Abstriche?
FAQ-ID -87
Bitte überprüfen Sie einige der folgenden Faktoren, die zu dieser Verwendung von unspezifisch beschichteten PCR-Lotionen beitragen können, und lesen Sie, wie sie vermieden werden können:
Vorlage zu weit ausführen
Überprüfen Sie den Fokus aller Öffnungsvorlagen. Stellen Sie Reihenverdünnungen des Nukleinsäureformats aus der Stammlösung her. Führen Sie PCR grundsätzlich durch, indem Sie diese seriellen Verdünnungen einstellen.
PC läuft langsam?
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Kontaminationsübertragung
Wenn die schädliche PCR-Kontrolle (keine Template-DNA) ein Gewichtsverlust-Supplement oder einen PCR-Tupfer zeigt, wechseln Sie alle Reagenzien. Verwenden Sie Einweg-Pipettenspitzen mit hydrophoben Filtern, um die Kreuzkontamination zu verringern. Platzieren Sie alle Reaktionsmischungen in einer getrennten Zone, die wiederum nicht für die DNA-Präparation oder PCR-Systemanalyse verwendet werden kann.
High Enzyme
Wenn HotStarTaq oder Taq DNA Polymerase ebenfalls verwendet wird, verwenden Sie 2 Einheiten von fünf verschiedenen pro 100 µl Reaktionsmischung.
Wie wird man einen Abstrich in der PCR wieder los?
„Wenn die PCR-Verteilung wie ein Abstrich aussieht, müssen Sie möglicherweise die Annealing-Bedingungen erhöhen oder die Magnesiummenge verringern (wenn der Kunde sehr wenig Magnesium hinzugefügt hat und es nicht bereits in einer neuen Mischung war). Er wird wahrscheinlich auch ein Modell hinzufügen. „Normalerweise würde ich vorschlagen, frisch zubereitete Gele und diese in frisch zubereitetem Laufpuffer zu verwenden.
Zu viele PCR-Zyklen
Reduzieren Sie die Anzahl der Phasen in Schritten von 3 Zyklen.
Suboptimaler Mg2+-Nachweis
PCR mit Endfaktor-Mg2+-Werten von 1,5 bis 5,0 Millimeter (in 0,5-mm-Schritten) der mitgelieferten 25-Millimeter-MgCl2-Lösung durchführen (siehe Tabelle unten):
< /str>
Mg2+ Endkonzentration in der Reaktion (mM)
1,5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Erforderliches Volumen bezogen auf 26 mM MgCl2 pro Reaktionskonzentration (µl)
0
2
4
6
8
10
12
14
Suboptimaler plus degradierter Primer
Wiederholen Sie die PCR mit verschiedenen Primerniveaus von 0,1 bis 0,5 µM pro für Anfänger (in 0,1 µM-Schritten). Achten Sie insbesondere bei der Durchführung einer hochempfindlichen PCR auf einen möglichen Abbau des Primers, um ein denaturierendes Polyacrylamidgel zu erhalten.
Wie behebt man Fehler bei einem Primer-Dimer?
Erhöhen Sie Ihre aktuelle Glühtemperatur.Erhöhen Sie die Zeit/Temperatur, die mit der Denaturierung der Vorlage verbunden ist.Reduzieren Sie die Konzentration des Bundes (10 pmol können funktionieren)Verwenden Sie eine Form von PCR-erhöhender Pille wie DMSO.Schau dir dein Modell an.Verwenden Sie gute Rang-Tags.
Primer-Design ist überhaupt nicht optimal
Wie behebt man Probleme mit dem perfekten Primer-Dimer?
Erhöhen Sie die Glühtemperatur.Zeit/Temperatur im Gerät mit Modelldenaturierung erhöhen.Verringern Sie die Primerkonzentration (10 pmol passen routinemäßig)Verwenden Sie einen PCR-Aktivator wie DMSO.Schau dir dein Modell an.Verwenden Sie Qualitäts-Tags.
CheckPassen Sie Ihr Design an und erstellen Sie originelle Grundierungen
Weitere Informationen zur Optimierung von PCR-Lösungen finden Sie in den Abschnitten im Anhang, die sich auf das jeweilige Taq PCR- und HotStarTaq DNA-Polymerase-Handbuch beziehen, sowie in unserer umfassenden Broschüre Critical Success Factors for PCR.
Mögliche Ursachen
Empfehlungen
DNA-Modelle
Schlechte Integrität
Minimierung von DNA-Brüchen und Brüchen während der Extraktion. Untersuchen Sie ggf. die Template-DNA durch Integritätsgelelektrophorese.
Lagern Sie die laufende DNA in molekularem Wasser oder TE 8-10 (ph.0)-Schild, um einen Abbau durch Nukleasen zu verhindern.
Geringe Reinheit
Befolgen Sie strikt die Empfehlungen des Herstellers, wenn Sie das Reinigungssystem für die DNA-Extraktion verwenden Schablone . Siehe Raucherratschläge und Leitfaden zur Fehlerbehebung, um DNA von geringer Qualität zu mindern.
Stellen Sie sicher, dass bei der Verwendung chemischer und/oder befolgen Sie enzymatische DNA-Reinigungsprotokolle nach Bedarf, stellen Sie sicher, dass möglicherweise keine und keine Rückstände von PCR-Inhibitoren wie Phenol, L- EDTA oder Proteinase K.
Reinigen Sie die DNA mit 70% Ethanol oder möglicherweise einem Präzipitat und reinigen Sie die DNA, um versteckte Salze oder einfach (z.B. Ionen, z.B. K+, Na< sup>+ usw.), die viele DNA-Polymerasen hemmen.
Wählen Sie DNA-Polymerasen mit hoher Prozessivität, die eine hohe Toleranz im Vergleich zu herkömmlichen PCR-Inhibitoren aufweisen, die zwischen Blut, Boden, Pflanzenkörperteilen, usw.
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Nicht genug
Überprüfen Sie die Menge der injizierten DNA und erhöhen Sie die Dollarzahl falls erforderlich.
DNA-Polymerasen mit der höchsten Audioempfindlichkeit auswählen.
Gegebenenfalls die Gesamtzahl der PCR-Zyklen erhöhen.
Komplexe Ziele (z.B. GC-reiche oder einfache High-School-Stru tures)
Wählen Sie DNA-Polymerasen mit überlegener Prozessivität, bei denen sie eine hohe Affinität für DNA-Stile aufweisen und auch besser geeignet sind, um lästige Quests zu verbessern. Verwenden Sie ein PCR-Additiv oder Co-Lösungsmittel, um DNA- und GC-reiche Sequenzen zu informieren. Fähigkeit zur Denaturierung von DNA, aber auch von Sekundärstrukturen.
Erhöhen Sie die Denaturierungszeit und/oder trennen Sie Templates, indem Sie doppelsträngige DNA in einem Klima verwenden -freundliche Weise.< /li>
Lange Scheiben
Überprüfen Sie die zulässige Tonlänge der Sorte der Polymerase-Genetik. Verwenden Sie DNA-Polymerasen, die speziell für unglaublich lange PCRs entwickelt wurden.
Wählen Sie DNA-Polymerasen mit sehr guter Prozessivität, sie können lange Ziele in kürzerer Zeit amplifizieren.
Verringern der Annealing-Temperatur und Elongation hilft bei Primern, chemischer Bindung und thermischer Stabilität.
Erhöhung der Gesamtelongationstage je nach Amplikonlänge.
Grundlagen < /td>
Problem Design
Überprüfen Sie die Grundlagen des Designs. Verwenden Sie geeignete Online-Design-Tools der Bundesregierung,
stellen Sie sicher, dass alle Primer mit dem gewünschten Ziel übereinstimmen.
Stellen Sie sicher, dass die Primer alle korrekten Stränge der Ziel-DNA unterstützen.
Alte Primer
Primer werden aliquotiert und ordnungsgemäß gelagert, im Allgemeinen bei der nächsten Resuspension.
Erneuern Sie frische Primer-Aliquots oder besorgen Sie sich erfrischende, wenn Primer benötigt werden.
< td>Nicht die richtige Menge
< td> td>
Optimieren Sie die Primerkonzentrationen (normalerweise jeweils im Bereich von 0,1–1 µM).
Langfristig PCR und PCR mit degenerierten Primern beginnen mit einer Mindestkonzentration von 0,5 μM.
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Andere Reaktion auf Komponenten
Ungeeignete DNA-Polymerase
Verwendung von Hot-Start-DNA, wenn Sie einen offensichtlichen Abbau erkennen möchten von Primern d durch Ausbessern der sportlichen Aktivität von 3′ ≤ 5′-DNA-Polymerase-Exonuklease. Hot-Start-DNA-Polymerasen erhöhen auch den Einzug ausgewählter PCRs mit Produkten, die auf unspezifische Amplifikation verzichten.
Sie können die PCR auch auf Eis programmieren, ansonsten fügen Sie die neueste DNA-Polymerase zum allergischen Reaktionsgemisch hinzu.< /li>
Unzureichender Satz an DNA-Polymerasen
Wählen Sie DNA-Polymerasen mit ausgezeichneter Empfindlichkeit für die Amplifikation.
li>< li> Überdenken Verwenden Sie die empfohlene DNA-Polymerase-Dosis innerhalb von PCRtrends und optimieren Sie sie gegebenenfalls.
Erhöhen Sie die DNA-Polymerase-Menge, wenn das Reaktionsgemisch eine funktional hohe Konzentration einer Chemikalie enthält (z.B. DMSO, Formamid) oder Proben von Inhibitoren aus jeglicher Quelle.
Unzureichende Aufmerksamkeit für Mg2+
< td>< ul>
Mg optimieren
Warum verschmiere ich wegen PCR?
DNA-Kontamination, RNA in DNA-Proben, hohe DNA-Werte in der PCR-Reaktion können ein Verschmieren rechtfertigen. Der DNA-Abstrich wird in der Regel bei Pflanzen aufgrund der hohen Sensibilisierung aller gegen die Modell-DNA ausgelöst. Überprüfen Sie daher bitte das tatsächliche Modell, nachdem es unter I skaliert wurde.
„Wenn die PCR-Produkte als Schlieren erscheinen, müssten Sie möglicherweise die Annealingtemperatur erhöhen oder das Mg herunterskalieren (wenn Sie Mg selbst hinzugefügt haben, war das Produkt noch nicht in der Mischung). Sie können auf jeden Fall viele Vorlagen hinzufügen.” Ich würde vorschlagen, frisch zubereitete Nudeln zu verwenden und ein frisch hergestelltes Objektivtubusschloss zu knacken.
