Olika Sätt Att Korrigera Primertäckning Vid PCR-felåterställning

by

Om du har Primer Smear på din dator för felsökning har vi en chans att den här guiden hjälper dig att fixa det.

Datorn går långsamt?

  • 1. Ladda ner ASR Pro från webbplatsen
  • 2. Installera det på din dator
  • 3. Kör skanningen för att hitta skadlig programvara eller virus som kan gömma sig i ditt system
    • Förbättra hastigheten på din dator idag genom att ladda ner den här programvaran - den löser dina PC-problem.

    Minska mängden av modellen.Öka typiskt glödgningstemperaturen.Använd landnings-PCR.Minska antalet PCR-cykler.Rita om primers.Använd kapslade primers.Förstärk en del av vår produkt.

    Minska antalet i mallen.Öka den specifika glödgningstemperaturen.Använd landnings-PCR.Minska antalet PCR-cykler hos människor.Grundombyggnad.Använd sammansatta primers.Förstärk resultatet igen.

    Varför upplever jag att jag blir utsmetad efter PCR?

    Som en generell regel bör den specifika PCR-produkten inte utsmetas på grund av den högre koncentrationen från mall-DNA. En hög koncentration av mall-DNA kommer vanligtvis att resultera i mycket tjocka band med gelprodukten, såvida inte ditt DNA är försämrat eller RNA inte är uppe om du vill specificera.hygien. DNA-kontamination, RNA i DNA-design, hög uppmärksamhet av DNA i PCR-reaktion kan motivera smetning.

    Varför får jag PCR-utstryk?

    FAQ ID -87

    Granska några av de engångsfaktorer som kan bidra till användningen av associerade icke-specifika belagda PCR-lotioner och förslag på vad du kan undvika dem:

  • pcr troubleshooting primer smear

    Kör webbdesign för långt

    Kontrollera fokus för öppningskonceptet. Gör serieutspädningar av nukleinsyraformat vid stamlösningen. Utför PCR genom att ställa in den här typen av serieutspädningar.

  • Datorn går långsamt?

    ASR Pro är den ultimata lösningen för dina PC-reparationsbehov! Den diagnostiserar och reparerar inte bara olika Windows-problem snabbt och säkert, utan den ökar också systemprestandan, optimerar minnet, förbättrar säkerheten och finjusterar din dator för maximal tillförlitlighet. Så varför vänta? Kom igång idag!


    Kontaminationsöverföring

    Om det negativa PCR-handtaget (ingen mall-DNA) visar ett kosttillskott å andra sidan PCR-pinne, byt alla reagenser. Använd bli av med pipettspetsar med hydrofoba filter för att minimera korskontaminering. Placera alla reaktionsblandningar i en separat zon, som faktiskt i sin tur inte kan användas för DNA-arrangemang eller PCR-systemanalys.

  • pcr troubleshooting federal Government smear

    Hög enzym

    Om HotStarTaq eller Taq DNA-polymeras används lika bra, använd 2 enheter av 5 per hundra µl reaktionsblandning.

  • Hur blir man av med en ansökan i PCR?

    “Om PCR-fördelningen ser ut som ett bestämt utstryk, kan du behöva öka dessa glödgningsförhållanden eller minska mängden mineral magnesium (om kunden själv har tillsatt magnesium och som det inte redan fanns i blandningen). Han kommer potentiellt att lägga till en modell också. “Jag skulle råda dig att använda nyberedda geler och köra dem i bara nyberedd löpbuffert.

    För många PCR-cykler

    Minska vårt antal faser i steg om olika cykler.

  • Suboptimal Mg2+-detektion

    Utför PCR med slutgiltiga Mg2+-utlåtanden från 1,5 till 5,0 mM (i steg om 0,5 millimeter) av den medföljande 25 mM MgCl2 prissatt (se tabell nedan):

    • < /str>

    Slutlig koncentration av Mg2+ i reaktionen (mM) 1,5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
    Erforderlig volym på 26 millimeter MgCl2 per reaktionskoncentration (µl) 0 2 4 6 8 10 12 14

  • Suboptimal eller modifierad primer

    Upprepa PCR med olika primerkoncentrationer från 0,1 till 0,5 µM per primer (i steg om 0,1 µM). Speciellt när du utför högkänslig PCR, se lämplig ut för eventuell nedbrytning av primern genom att helt enkelt denaturera polyakrylamidgel.

  • Hur sköter du dig felsöka en primerdimer?

    öka glödgningstemperaturen.Öka dessa tider/temperaturer i samband med layoutdenaturering.Minska koncentrationen av primern (10 pmol kan mycket väl fungera)Använd någon form av PCR-förstärkare såsom för DMSO.Titta på din modell.Använd taggar av bra kvalitet.

    Primer-temat är inte alls optimalt

    Hur felsöker du en federal regeringsdimer?

    Öka glödgningstemperaturen.Öka tid/temperatur i kombination med typdenaturering.Minska primerkoncentrationen (10 pmol passar utan ansträngning)Använd en PCR-aktivator som DMSO.Titta på hela din modell.Använd kvalitetstaggar.

    Kontrollera Anpassa din design och skapa tidigare primers

    • För mer information om att optimera PCR-lösningar, observera avsnitten i bilagan som är relaterade till Taq PCR och HotStarTaq DNA Polymerase-manualen, samt se vår omfattande broschyr Critical Success Factors for PCR.

    < td>Inte tillräckligt < td> td>

    < td>

    Möjliga orsaker Rekommendationer
    DNA-modeller

    /td>

    Dålig integritet
    • Minimering av DNA-avbrott till raster under extraktion. Vid behov, utvärdera mall-DNA med integritetsgelelektrofores.
    • Förvara rinnande DNA över molekylärt vatten eller TE 8-10 (ph.0)-buffert för att minska nedbrytningen av nukleaser.
    Låg renhet
    • Följ strikt bilrekommendationerna när du använder rengöringssatsen för DNA-extraktion Mall . Se rökguide och problemlösningsguide för att lindra lågkvalitets-DNA.
    • Se till att när du någonsin använder kemiska och/eller följ reglerna för enzymatisk DNA-rening efter behov, se till att det inte finns några och kvarvarande PCR-hämmare som fenol, l- EDTA och proteinas K.
    • Rena DNA med 70 % etanol eller fäll ut och detox DNA för att ta bort dolda salter eller (t.ex. joner, t.ex. K< sup>+, Na+ , etc.) som hämmar ett fåtal DNA-polymeraser.
    • Välj DNA-polymeraser med hög processivitet som uppvisar hög tolerans jämfört med konventionella PCR-hämmare som i sin tur finns mellan blod, jord, växtvävnader osv.

    < /td>

    Inte tillräckligt
    • Kontrollera mängden DNA som injiceras och öka dollarbeloppet när det behövs .
    • Välj DNA-polymeraser med den högsta amplifieringskänsligheten.
    • Öka den totala mängden om nödvändigt PCR-cykler.
    Komplexa planer (t.ex. GC-rika eller enkla sekundära strukturer)

  • Välj DNA-polymeraser med överlägsen processivitet som uppvisar högst viss affinitet för DNA-stilar och bättre y är anpassad för att förbättra irriterande mål. Använd en bra PCR-tillsats eller hjälplösningsmedel för att hjälpa DNA men GC-rika sekvenser. Förmåga att denaturera DNA och legitima strukturer.
  • Öka denatureringstiden och/eller separera mallar från dubbelsträngat DNA i ett klimat- vänligt sätt.< /li>
    • Långa mål
    • Kontrollera en tillåten ljudlängd för den valda polymerasen din ålder. Använd DNA-polymeraser speciellt designade för otroligt stora PCR.
    • Välj DNA-polymeraser med hög processivitet, de kan mycket väl förstärka långa mål på kortare tid.
    • Reducering av hybridiseringsmiljö och förlängning hjälper till med primers, enzymbindning dessutom termisk stabilitet.
    • Ökning av total förlängningstid beroende på amplikonlängd.
    Primers < /td>
    Problemdesign
    • Kontrollera grunderna för design. Använd lämpliga onlinedesignverktyg från myndigheter,
    • se till att alla primers matchar det aktuella målet av intresse.
    • Se till att primers är komplementära till var och en av de korrekta strängarna i mål-DNA:t.
    Gamla primers
    • Primers kommer med största säkerhet att alikvoteras och lagras korrekt i allmänhet efter resuspension.< /li>
    • Återställ snygga och rena primeralikvoter eller skaffa nya i de fall primers behövs.
    • Optimera primerkoncentrationer (vanligtvis i det breda urvalet av 0,1-1 µM vardera).
    • För lång PCR, och eftersom PCR med degenererade primers, börja med en standardkoncentration på 0 ,5 μM.
    • li>
    Annan typ av svar på komponenter
    Olämpligt DNA-polymeras
    • Användning av hot-start DNA för att detektera observerbar nedbrytning av primers d genom att korrigera sportunderhållningsaktiviteten för 3’≤5′ DNA-polymerasexonukleas. Hot-out-DNA-polymeraser ökar också utbytet av mycket begränsade PCR med produkter som eliminerar ospecifik amplifiering.
    • Du kommer förmodligen också att programmera PCR på is eller lägga till ett senaste DNA-polymeras till reaktionsblandningen.
    Otillräcklig uppsättning DNA-polymeraser
    • Välj DNA-polymeraser som har utmärkt känslighet för amplifiering.

      • < li> Ompröva användningen förstår du, den rekommenderade dosen av DNA-polymeras i PCR-trends optimerar dessutom vid behov.

    • Öka mängden DNA-polymeras om reaktionsblandningen innehåller en hög betoning av en kemikalie (t.ex. DMSO, formamid) eller småprovshämmare från vilken källa som helst.
    Otillräcklig koncentration från all Mg2+