Różne Sposoby Korygowania Rozmazywania Startera Podczas Odzyskiwania Błędu PCR

by

Jeśli masz na swoim komputerze rozmazywanie podkładu do rozwiązywania problemów, mamy nadzieję, że ten przewodnik pomoże ci to naprawić.

Komputer działa wolno?

  • 1. Pobierz ASR Pro ze strony internetowej
  • 2. Zainstaluj go na swoim komputerze
  • 3. Uruchom skanowanie, aby znaleźć złośliwe oprogramowanie lub wirusy, które mogą czaić się w twoim systemie
    • Już dziś popraw szybkość swojego komputera, pobierając to oprogramowanie - rozwiąże ono problemy z komputerem.

    Zmniejsz ilość razem z modelem.Zwiększ temperaturę wyżarzania.Użyj lądowania PCR.Zmniejsz tę liczbę cykli PCR.Przerysowanie podkładów.Użyj podkładów ułożonych w stos.Wzmocnij część produktu.

    Zmniejsz serię w szablonie.Zwiększ temperaturę wyżarzania.Użyj lądowania PCR.Zmniejsz liczbę cykli PCR u ludzi.Remodeling fundamentów.Użyj podkładów combo.Ponownie wzmocnij produkt.

    Dlaczego zasłaniam się po PCR?

    Zgodnie z ogólną zasadą, nie powinno się rozmazywać produktu PCR, gdy potrzebne jest wyższe stężenie matrycy DNA. Imponująca koncentracja matrycowego DNA zwykle skutkuje powstaniem bardzo grubych prążków na produkcie żelowym, poza tym, że DNA jest degradowane lub RNA nie spełnia specyfikacji.higiena. Zanieczyszczenie DNA, projektowanie DNA RNA, wysokie stężenie DNA w reakcji PCR może powodować rozmazywanie.

    Dlaczego otrzymuję rozmazy PCR?

    ID FAQ -87

    Proszę zapoznać się z niektórymi z następujących czynników, które mogą mieć wpływ na stosowanie niespecyficznych, powlekanych kremów do skóry PCR i sugestiami, jak ich unikać:

  • pcr rozwiązywanie problemów z rozmazywaniem podkładu

    Uruchom szablon za daleko

    Sprawdź ostrość szablonu otwierającego. Wykonaj seryjne rozcieńczenia połączone z formatem kwasu nukleinowego z roztworu podstawowego. Wykonaj PCR, ustawiając te seryjne rozcieńczenia.

  • Komputer działa wolno?

    ASR Pro to najlepsze rozwiązanie dla potrzeb naprawy komputera! Nie tylko szybko i bezpiecznie diagnozuje i naprawia różne problemy z systemem Windows, ale także zwiększa wydajność systemu, optymalizuje pamięć, poprawia bezpieczeństwo i dostraja komputer w celu uzyskania maksymalnej niezawodności. Więc po co czekać? Zacznij już dziś!


    Przenoszenie zanieczyszczeń

    Jeśli ta konkretna negatywna kontrola PCR (bez matrycy DNA) pokazuje suplement diety lub wacik PCR, zmień każdy z odczynników. Użyj jednorazowych końcówek do pipet z filtrem hydrofobowym, aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe. Umieść wszystkie mieszaniny reakcyjne w oddzielnej strefie, która z kolei nie będzie mogła zostać użyta do przygotowania DNA lub analizy przebiegu PCR.

  • pcr do rozwiązywania problemów z rozmazywaniem startera

    Wysoki enzym

    Jeśli używana jest również HotStarTaq lub Taq DNA Polymerase, użyj 2 właściwości 5 na 100 µl mieszaniny rozdzielczości.

  • Jak pozbyć się rozmazu w PCR?

    „Jeśli rozkład PCR wygląda jak rozmaz, być może będziesz musiał obecnie zwiększyć warunki wyżarzania lub zmniejszyć jedną konkretną ilość magnezu (jeśli klient sam dostarczył magnez, a nie było to już w odniesieniu do mieszanki). Pewnie doda model, że dobrze. „Sugerowałbym użycie świeżo przygotowanych past i rozprowadzenie ich w świeżo przygotowanym buforze.

    Zbyt wiele cykli PCR

    Zmniejsz liczbę faz, stosując przyrosty co 3 cykle.

  • Suboptymalne wykrywanie Mg2+

    Przeprowadź PCR wśród końcowych zmiennych wartości Mg2+ od 1,5 do 5,0 mM (w krokach co 0,5 mm) w wyposażonym 25 mM roztworze MgCl2 (patrz tabela poniżej):

    • < /str>

    Końcowe stężenie Mg2+ w odpowiedzi na (mM) 1,5 2.0 2,5 3.0 3.5 4.0 4,5 5,0
    Wymagana objętość 26 mM MgCl2 na procent reakcji (µl) 0 2 4 6 8 10 12 14

  • Suboptymalny lub zdegradowany starter

    Powtórz PCR z kilkoma innymi stężeniami starterów od 0,1 do 0,5 µM w odniesieniu do startera (w krokach co 0,1 µM). Zwłaszcza podczas przeprowadzania PCR o wysokiej czułości, szukaj możliwej degradacji najważniejszego podkładu za pomocą denaturującego żelu poliakryloamidowego.

  • Jak rozwiązywać problemy z dimerem 101?

    zwiększyć temperaturę wyżarzania.Zwiększ czas/wilgotność związaną z denaturacją szablonu.Zmniejsz stężenie jednego konkretnego podkładu (może działać 10 pmol)Użyj jakiegoś formularza o wzmacniaczu PCR, takim jak DMSO.Spójrz na model swojej firmy.Używaj tagów dobrej jakości.

    Projekt podkładu nie jest tutaj wcale optymalny

    Jak twoje potrzeby rozwiązywać problemy ze starterem dimerem?

    Zwiększ temperaturę wyżarzania.Zwiększ czas/temperaturę, jeśli chodzi o połączenie z denaturacją modelu.Zmniejsz poziom zawartości podkładu (10 pmol automatycznie pasuje)Użyj aktywatora PCR typu DMSO.Spójrz na swój model.Używaj znaczników jakości.

    SprawdźDostosuj projekty i stwórz oryginalne podkłady

    • Aby uzyskać więcej informacji na temat optymalizacji roztworów PCR, zapoznaj się z sekcjami załącznika dotyczącymi instrukcji Taq PCR i HotStarTaq DNA Polymerase, a także z naszą obszerną broszurą Krytyczne czynniki sukcesu dla PCR.

    < td>Za mało < td> td>

    < td>

    Możliwe przyczyny Zalecenia
    Modele DNA
    Słaba integralność
    • Minimalizowanie pęknięć DNA i pęknięć podczas ekstrakcji. Jeśli to konieczne, oceń matrycowy DNA za pomocą elektroforezy z traktowaniem integralności.
    • Przechowuj DNA w wodzie molekularnej lub buforze TE 8-10 (ph.0), aby zapobiec degradacji przez nukleazy.
    Niska czystość
    • Ściśle przestrzegaj zaleceń producenta podczas korzystania z zestawu czyszczącego do ekstrakcji DNA Szablon . Zobacz przewodnik palenia i przewodnik rozwiązywania problemów, aby złagodzić bardzo niską jakość DNA.
    • Upewnij się, że podczas stosowania chemicznego i/lub zgodnego z protokołami enzymatycznego oczyszczania DNA w razie potrzeby, upewnij się, że w tym miejscu nie ma ani pozostałości inhibitorów PCR, takich jak fenol, l-EDTA i proteinaza K.
    • Ponownie oczyść DNA 70% etanolem lub nawet osadem i oczyść DNA, aby usunąć ukryte sole lub (np. jony, np. K+, Na + itp.), które hamują wiele polimeraz DNA.
    • Wybierz polimerazy DNA o większej procesywności, które wykazują wysoką tolerancję w porównaniu z faktycznie konwencjonalnymi inhibitorami PCR, które znajdują się między krwią, podłożem, tkankami roślinnymi, itp.

    < /td>

    Za mało
    • Sprawdź ilość wstrzykniętego DNA i zwiększ kwotę w dolarach w razie potrzeby.
    • Wybierz polimerazy DNA o zazwyczaj najwyższej czułości amplifikacji.
    • Zwiększ całkowitą ilość w kluczowych cyklach PCR.
    Złożone cele (np. bogate w GC lub stan dard drugorzędowe struktury)
    • Wybierz polimerazy DNA z najnowocześniejszą procesywnością, które wykazują wysokie pewne powinowactwo do stylów DNA i lepsze x jest przystosowane do maksymalizacji nieznośnych celów. Użyj dodatku PCR lub być może współrozpuszczalnika, aby wspomóc sekwencje bogate w DNA i GC. Możliwość denaturacji DNA i struktur drugorzędowych.
    • Wydłuż czas denaturacji i/lub części szablonów z dwuniciowego DNA w przyjazny dla klimatu.< /li>
    Długie cele
    • Sprawdź dopuszczalną długość dźwięku połączonego z wybranymi genetyka polimerazy. Używaj polimeraz DNA specjalnie zaprojektowanych do niewiarygodnie długich reakcji PCR.
    • Wybierz polimerazy DNA ze względu na wysoką produktywność, mogą one amplifikować długie cele obecne w krótszym czasie.
    • Zmniejszenie temperatury przyłączania i wydłużenia pomaga starterom , wiązanie enzymów i stabilność termiczna.
    • Zwiększenie ogólnego czasu wydłużania w zależności od długości amplikonu.
    Podkłady
    Problem z projektowaniem
    • Sprawdź podstawy za pomocą projektowania. Użyj odpowiednich narzędzi do tworzenia online rządu federalnego,
    • upewnij się, że wszystkie startery pasują do celu będącego przedmiotem zainteresowania.
    • Upewnij się, że startery prawdopodobnie są komplementarne do wszystkich prawidłowych nici, które widzisz, docelowego DNA.
    Stare startery
    • Podkłady są dzielone na równe części i są odpowiednio lokalizowane po ponownym zawieszeniu.
    • Przywróć świeże porcje podkładu i uzyskaj nowe, jeśli podkłady są potrzebne.
    • Zoptymalizuj poziomy starterów (zwykle w zakresie 0,1-1 µM każdy).
    • Dla szczególnie długi PCR, a dla PCR ze starterami transformacyjnymi, zacznij od minimalnego stężenia 0,0 μM.
    • li>
    Inne reakcje na składniki
    Niewłaściwa polimeraza DNA
    • Użyj w połączeniu z hot-start DNA w celu wykrycia widocznej degradacji starterów oraz poprzez korektę aktywności sportowej 3’≤5′ egzonukleazy polimerazy DNA. Polimerazy DNA Hot start poprawiają również wydajność wybranych reakcji PCR z produktami, dzięki czemu eliminują niespecyficzną amplifikację.
    • Można również zaprogramować PCR przez lód lub dodać najnowszą polimerazę DNA do mieszaniny reakcyjnej.

      • < /ul >
    Nieodpowiedni zestaw polimeraz DNA
    • Wybierz polimerazy DNA o doskonałej czułości jak do amplifikacji.

      • < li> Rozważ ponownie Użyj zalecanej dawki polimerazy DNA w trendach PCR i w razie potrzeby zoptymalizuj.

    • Zwiększ własną ilość polimerazy DNA, jeśli roztwór reakcyjny zawiera wysokie stężenie substancji naturalnej i organicznej (np. DMSO, formamid) lub próbki inhibitorów z danego źródła.
    Niewystarczające stężenie Mg2+