Vari Modi Per Risolvere La Macchia Di Primer Nel Ripristino Degli Errori Della PCR

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Se gli acquirenti dispongono di Primer Smear sul tuo computer per la risoluzione dei problemi, speriamo che questa guida ti aiuti a correggerlo.

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    Riduci la quantità di quei modelli.Aumentare la temperatura di ricottura.Usa la PCR di atterraggio.Ridurre il numero proveniente da tutti i cicli di PCR.Ridisegnare i primer.Usa primer nidificati.Rafforzare parte del prodotto.

    Riduci il numero in come il modello.Aumentare la temperatura di ricottura.Usa la PCR di atterraggio.Ridurre la scelta dei cicli PCR negli esseri umani.Rimodellamento delle fondamenta.Usa primer per miscele.Rafforzare nuovamente il prodotto.

    Perché mi sbava dopo la PCR?

    Come regola generale, non dovrebbe esserci alcuna copertura del prodotto della PCR a causa della notevole concentrazione del DNA stampo. Una concentrazione elevata più tipicamente associata al DNA stampo risulterà solitamente in bande molto ferme sul prodotto in gel, a meno che il vostro DNA non sia degradato o l’RNA non sia di per sé conforme alle specifiche. La contaminazione del DNA, la caratteristica dell’RNA nel DNA, l’elevata concentrazione di DNA nella reazione PCR molto probabilmente causeranno sbavature.

    Perché ricevo strisci PCR?

    ID FAQ -87

    Rivedi alcuni dei seguenti fattori collegati che possono contribuire all’intero utilizzo di lozioni PCR rivestite non specifiche e passaggi su come evitarle:

  • pcr risoluzione dei problemi di striscio di primer per vernice

    Esegui il modello troppo lontano

    Controlla il focus di come il modello di apertura. Effettuare diluizioni seriali di Nucleic Acid Format dalla soluzione madre. Eseguire la PCR come risultato dell’impostazione di queste diluizioni seriali.

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    Trasferimento di contaminazione

    Se il controllo PCR negativo (nessun DNA modello) mostra un supplemento nutrizionale o un tampone PCR, cambia tutti i reagenti. Utilizzare puntali monouso con filtri idrofobici per affettare la contaminazione incrociata. Posizionare tutte le miscele di reazione in una zona differenziata, che, a sua volta, non può essere utilizzata come preparazione del DNA o analisi del sistema PCR.

  • striscio di primer per la risoluzione dei problemi di pcr

    Alto enzima

    Se si utilizza anche HotStarTaq o Taq DNA Polymerase, utilizzare 2 unità da 9 per 100 µl di miscela di reazione.

  • Come ci si libera di uno striscio nella PCR?

    “Se gli stili di distribuzione della PCR sono come uno striscio, potrebbe essere necessario sovralimentare le condizioni di ricottura o ridurre la quantità incluso il magnesio (se il cliente ha aggiunto il magnesio stesso e non era già in tutto il mix). Probabilmente aggiungerà anche un modello. “Probabilmente suggerisco di usare gel appena preparati e di sprintarli in un tampone da corsa appena preparato.

    Troppi cicli di PCR

    Ridurre il numero di fasi con incrementi relativi a 3 cicli.

  • Rilevamento non ottimale di Mg2+

    Esegui la PCR con valori finali di Mg2+ modificabili da 1,5 a 5,0 millimetri (con incrementi di 0,5 mm) della soluzione di MgCl2 da 25 millimetri fornita (vedi tabella sotto):

    • < /str>

    Obiettivo finale di Mg2+ nella reazione (mM) 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
    Volume richiesto con 26 mM MgCl2 per concentrazione di reazione (µl) 0 2 4 6 8 10 12 14

  • Non ottimale o potrebbe essere un primer degradato

    Ripetere la PCR con livelli di primer diversi da 0,1 a 0,5 µM per governo federale (con incrementi di 0,1 µM). Soprattutto quando si esegue la PCR ad alta sensibilità, cercare la possibile degradazione del primer utilizzando un gel di poliacrilammide denaturante.

  • Come si risolve un dimero di primer?

    aumentare come la temperatura di ricottura.Aumentare il tempo/la temperatura associati considerando la denaturazione del templato.Ridurre la concentrazione del governo federale (10 pmol potrebbero funzionare)Utilizzare una qualche forma di prodotto PCR come DMSO.Guarda il tuo modello.Usa buoni tag sostanziali.

    Il design del primer non è affatto ottimale

    Come si risolve un singolo dimero di primer?

    Aumentare la temperatura di ricottura.Aumenta il tempo/temperatura in fusibile con la denaturazione del modello.Diminuire la concentrazione di primer (10 pmol si adattano subito)Utilizzare un attivatore PCR come DMSO.Guarda il tuo modello.Usa tag di qualità.

    Controlla Personalizza il tuo design e poi crea primer originali

    • Per ulteriori informazioni sull’ottimizzazione delle soluzioni PCR, vedere le sezioni dell’appendice relative al manuale Taq PCR e HotStarTaq DNA Polymerase, semplicemente perché e al nostro opuscolo completo Critical Success Factors for PCR.

    < td>Non in abbondanza < td> td>

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    Possibili cause Raccomandazioni
    Modelli di DNA
    Modelli di DNA /td>
    Integrità scarsa
    • Ridurre al minimo le rotture del DNA e le rotture durante l’estrazione. Se necessario, pesare il DNA modello mediante elettroforesi su gel di integrità.
    • Conservare il DNA in esecuzione in acqua molecolare o flusso TE 8-10 (ph.0) per prevenire la degradazione da parte delle nucleasi.
    Bassa purezza
    • Prestare scrupolosamente le raccomandazioni del produttore quando si utilizza il pacchetto di pulizia per Modello di estrazione del DNA. Vedere l’ebook sul fumo e la guida alla risoluzione dei problemi per mitigare il DNA di bassa qualità.
    • Assicurarsi che quando si utilizzano i protocolli di purificazione del DNA chimico e/o enzimatico secondo necessità, assicurarsi che non vi siano inibitori della PCR tipicamente assenti e residui come il fenolo, l-l- EDTA in aggiunta alla proteinasi K.
    • Ripurificare il DNA con il 70% di etanolo e per precipitare e purificare il DNA per rimuovere i sali nascosti o talvolta (ad esempio ioni, ad esempio K+, Na+, ecc.) che spesso inibiscono molte DNA polimerasi.
    • Scegli DNA polimerasi ad alta processività che mostrano un’elevata tolleranza rispetto ai convenzionali inibitori della PCR che si trovano tra sangue, suolo, struttura della pianta, ecc.

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    Non abbastanza
    • Controllare il DNA iniettato e aumentare la spesa in dollari se necessario.
    • Selezionare le DNA polimerasi con la più alta sensibilità audio.
    • Aumentare la quantità totale, se necessario, i cicli PCR.
    Target complessi (es. strutture extra ricche di GC o semplici ). Utilizzare un additivo per PCR o un co-solvente per facilitare il DNA e le sequenze ricche di GC. Possibilità di denaturare il DNA o le strutture secondarie.
  • Aumentare il tempo di denaturazione e/o separare i modelli nel DNA a doppio filamento in un modo rispettoso del clima.< /li>
    • Obiettivi lunghi
    • Controlla la lunghezza del suono consentita del deciced sulla genetica della polimerasi. Usa DNA polimerasi appositamente progettate per PCR incredibilmente lunghe.
    • Scegli DNA polimerasi con alta processività, possono amplificare bersagli lunghi in molto meno tempo.
    • Ridurre la temperatura di ricottura e l’allungamento aiuta a primer, legame chimico e stabilità termica.
    • Aumento dell’occasione di allungamento totale a seconda della lunghezza dell’amplicone.
    Primer
    Problem Design
    • Verifica le basi del design. Utilizzare gli strumenti di progettazione online appropriati del governo federale,
    • assicurarsi che i primer corrispondano interamente all’obiettivo di interesse.
    • Assicurarsi che i primer siano sottomessi a tutti i filamenti corretti del DNA target.
    Vecchi primer
    • I primer vengono aliquotati e conservati correttamente generalmente dopo la risospensione.
    • Ripristina aliquote di primer fresche o acquistane di nuove se sono necessari primer.
    • Ottimizza le concentrazioni di primer (di solito per un intervallo di 0,1-1 µM ciascuno).
    • Per la PCR lunga, e per la PCR con primer degenerati, partire da una concentrazione minima di 0,5 μM.
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    Altre reazioni ai componenti
    DNA polimerasi inappropriata
    • Uso di DNA hot-start che rileverebbe l’apparente degradazione dei primer d mediante rammendo l’attività sportiva dell’esonucleasi della DNA polimerasi 3’≤5′. Le DNA polimerasi hot start aumentano anche la fornitura di PCR selezionati con prodotti che bloccano l’amplificazione non specifica.
    • Puoi anche programmare la PCR su ghiaccio o persino aggiungere l’ultima DNA polimerasi alla miscela di risposta.
    Set di DNA polimerasi inadeguato
    • Scegliere DNA polimerasi con un’eccellente sensibilità per l’amplificazione.

      • < li> Riconsiderare Utilizzare la dose raccomandata di DNA polimerasi attorno a PCRtrends e ottimizzarla se necessario.

    • Aumentare la quantità di DNA polimerasi se la miscela di reazione contiene un’alta concentrazione di una sostanza chimica (ad es. DMSO, formammide) o inibitori del campione da qualsiasi fonte.
    Quantità insufficiente di Mg2+