Resolução de problemas de transformação bacteriana

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Aqui estão outras etapas simples que podem ajudá-lo a corrigir esses problemas de transformação bacteriana.

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3. Execute a verificação para encontrar qualquer malware ou vírus que possa estar à espreita em seu sistema

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Estágios de transformação bacteriana Desenvolvimento de habilidades, ligação do DNA à superfície celular, processamento e / ou captação de DNA capaz (geralmente em uma direção específica de dois ‘para 5’), etc. Integração do DNA nesse cromossomo por recombinação.

A transformação bacteriana pode ser o processo comum particular em laboratórios de biologia molecular. Depois de comprar a reação de ligação com células competentes associadas a Escherichia coli e plaquear cada célula em uma boa placa sólida, tudo o que você precisa fazer é esperar até que um grande número de colônias se forme no tópico da placa no dia seguinte.

Mas você normalmente encontra problemas comuns com o seu copo, como sem colônias, colônias saturadas ou muitas colônias. Isso fornece vários fatores que geralmente contribuem para uma excelente transformação bacteriana e uma quantidade de informações rápidas de solução de problemas para resolver seus problemas pós-processo de conversão.

Quais fatores quase sempre influenciam uma transformação bem-sucedida?

Por que minha eficiência de transformação é tão baixa?

Os fatores que influenciam esse aumento de eficiência são a cepa bacteriana, qualquer fase de crescimento da colônia bacteriana, o arranjo da mistura de transformação e, além disso, a condição do tamanho do DNA estranho.

1 Eficiência da transformação bacteriana de células competentes

Células microscópicas competentes com baixa eficiência de transformação formam um pequeno número ou nenhuma colônia conforme as placas crescem. Para obter a eficiência de transformação, use um plasmídeo não cortado em uma concentração conhecida adequada, como pUC19, para transformar células experientes.

Como calcular a eficiência de conversão

Não há eficiência de transformação. unidades formadoras de colônias ordenadas pela conversão de 1 μg de DNA de plasmídeo dentro de um determinado volume absoluto de células competentes.

Como exemplo, o poderoso SR converteu 1 μL (10 pg / μL) de pUC19 em 26 μL de células GoldBio DH10B quimicamente competentes.

Em seguida, você adicionou 975 μL de meio de cicatrização ao tubo. Eles diluíram dez μl em um extrato de 990 μl e dispensaram um par de μl de meio diluído.

No dia seguinte, um indivíduo contou 250 colônias na pilha.

Colônias implica em 250
Um μg de DNA contém 0,00001 (ou 10 pg = 0,00001 μg).
Diluição corresponde a X 10/1000 50/1000 implica 0,0005

Para cada plasmídeo pequeno como semelhante, pUC19, 5,0 CFU / μg 10 ^ten é uma ET relativamente alta. Portanto, todas as células competentes são altamente eficientes.

Para obter detalhes disponíveis sobre como calcular essa conversão de eficiência de suas células competentes, veja o vídeo GoldBio abaixo:

2º Plasmídeo

O plasmídeo de segunda mão na transformação pode afetar a eficácia da diferença. Por exemplo, a eficiência de transformação usando maior eficácia de plasma também é geralmente menor do que o desempenho geral com este pequeno plasmídeo. A fim de fazer mágica em um enorme plasmídeo, a seleção correta de células experientes e, portanto, a técnica de eletroporação pode ajudar a aumentar a eficiência de transformação.

Outro fator que você precisa considerar é comparar a concentração de DNA com a recomendada pelo seu protocolo. Com base no tipo de processo para a Estrutura Celular Quimicamente Competente GoldBio DH10B, as quantidades recomendadas de DNA para remodelação são de 1 pg a 100 ng associados ao DNA. Portanto, 1 μl de um tipo de resposta de ligação com pelo menos 1 μg de DNA certamente poderia ser usado para transformar essas células.

finalmente meio de cultura

As bactérias transformadas usaram choque térmico constante ou frequência de pulso elétrico para criar poros temporários em sua parede, ou possivelmente na parede. Portanto, eles podem facilmente “capturar” todo o DNA do plasmídeo. Para se recuperar dessa invasão, as células do tecido devem viver e crescer em um estabelecimento rico em nutrientes, como o SOC.

Mais sobre isso é uma mídia completamente fantástica, leia o artigo GoldBio abaixo.

Uma visão geral do ambiente SOC e as condições para um reparo celular competente

4ª temperatura

A temperatura desempenha um papel fundamental nas vendas de bactérias, especialmente na transformação de células quimicamente temperadas.

Por exemplo, a etapa de choque térmico para as células GoldBio DH10B quimicamente competentes requer uma pesquisa gradual: incubação a 0 ° C por 30 unidades de Trafone e, em seguida, incubação a 42 ° C para fazer 55 segundos e novamente a 0 ° C por 2 minutos. A etapa errada neste tipo de processo pode afetar o resultado da reforma.

Imediatamente após a transformação, as células transformadas precisam de aquecimento a 37 ° C para florescer. Uma maneira de fazer isso é obter uma incubadora de agitação. Esta incubadora também distribui nutrientes dos alimentos uniformemente para todas as células no meio da primavera.

5. Seleção de antibióticos

O antibiótico prescrito em sua placa afeta o número de colônias sem fio que se desenvolvem na placa devido à transformação. Usar o antibiótico errado para evitar a titulação geral do crescimento de colônias na placa. O simples uso do antibiótico em uma concentração muito baixa causa o crescimento de bactérias em seus gramados. Um importante gramado bacteriano é o aparecimento de micróbios em seu prato, que formam uma camada relacionada à fixação.

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Para garantir que você está aplicando o antibiótico correto, teste o marcador selecionável em um plasmídeo humano. O marcador selecionável é normalmente um gene de peso de antibiótico. Por exemplo, se um único plasmídeo real contém um gene de resistência à ampicilina, publique ampicilina na placa para separar as células não transformadas. Portanto, apenas as células transformadas crescem na placa.

Qualquer que seja o antibiótico usado, lembre-se para sempre de que incubar este comprimido por mais de 16 horas pode certamente causar o crescimento de colmeias-satélite.