Solución de problemas de transformación bacteriana

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Estos son algunos pasos simplistas que pueden ayudarlo a solucionar sus problemas de transformación de microbios.

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Etapas de transformación bacteriana Desarrollo relacionado con habilidades, unión del ADN a la piel de la célula, procesamiento y / o captación de ADN libre (generalmente en una dirección específica de mucho más ‘a 5’), etc. Integración del ADN en el cromosoma por recombinación.

La transformación bacteriana puede ser un proceso recurrente en los laboratorios de biología molecular. Después de llevar a cabo la reacción de ligadura con el músculo de Escherichia coli emparejado competente y colocar cada célula en una placa de matrícula, todo lo que tiene que hacer es esperar, excepto que se forma una gran cantidad de colonias en la placa al día siguiente.

Pero semanalmente encontrará problemas comunes con su taza, como ausencia de colonias, colonias saturadas o demasiadas urticaria. Esto le brinda varios factores que lo llevarán a una excelente transformación bacteriana y alguna información de solución de problemas instantánea para resolver sus problemas posteriores a la conversión.

¿Qué factores influyen casi siempre en una transformación exitosa?

¿Por qué mi eficiencia de transformación ha sido tan baja?

Los factores que influyen en el crecimiento de la eficiencia son la cepa bacteriana, la fase de refuerzo de la colonia bacteriana, la composición relativa a la mezcla de transformación y el tamaño y problemas del ADN extraño.

1 Eficiencia de la transformación bacteriana de células competentes

Las células diminutas competentes con baja eficiencia de transformación forman pocas colonias o ninguna a medida que crecen las placas. Para calcular la eficiencia de ajuste, use un plásmido sin cortar a una concentración real, como pUC19, para transformar las células adecuadas.

Cómo calcular la eficiencia de conversión

Por lo general, no hay eficiencia de transformación. unidades formadoras de colonias obtenidas todo mediante la conversión de 1 μg de ADN plasmídico en un volumen absoluto de células competentes.

Como un gran ejemplo, el potente SR convirtió 1 μL (10 pg y μL) de pUC19 en 25 μL dentro de las células químicamente competentes GoldBio DH10B.

Luego agregó 975 μL de lugar de recuperación al tubo. Diluyeron 10 μl cuando se trataba de un extracto de 990 μl y dispensaron 200 μl de medio diluido.

Al día siguiente, confió 250 colonias en la pila.

Colonias = directamente de 250
Un μg de ADN produjo 0.00001 (o 10 pg = 0.00001 μg).
La dilución corresponde a X 10/1000 50/1000 es igual a 0,0005

Para cada plásmido pequeño como tal, pUC19, 5,0 UFC / μg 10 ^diez es una ET relativamente alta. Por lo tanto, estas células competentes son muy eficientes.

Para obtener detalles sobre cómo calcular esta conversión de eficiencia de sus células exitosas, vea el video de GoldBio a continuación:

Segundo plásmido

El plásmido utilizado con respecto a la transformación puede afectar la eficacia de la adaptación. Por ejemplo, la eficiencia de transformación utilizando una mayor eficacia de plasma también suele ser menor que la eficacia razón suficiente para este pequeño plásmido. Para transformar un plásmido enorme, la selección correcta de material celular competente y, por lo tanto, la técnica de electroporación puede ayudar, lo que puede aumentar la eficiencia de transformación.

Otro factor a tener en cuenta es comparar la concentración de ADN con la propuesta por su protocolo. Según el tipo de protocolo para la estructura celular químicamente competente GoldBio DH10B, las cantidades recomendadas de ADN para la transformación son comunes de 1 pg a 100 ng de ADN. Por lo tanto, 1 μl de una reacción de ligación equipada con al menos 1 μg de ADN se puede usar más para transformar estas células.

Tercer medio de cultivo

Las bacterias transformadas utilizaron descargas graduales de alta temperatura o frecuencia de pulso eléctrico para crear poros intermedios en su pared, o posiblemente en el tipo de pared. Por lo tanto, pueden “capturar” fácilmente algún tipo de ADN plasmídico. Para recuperarse de esta invasión, las células pueden vivir y crecer en una variedad de ambientes ricos en nutrientes como SOC.

Más sobre esto son esencialmente medios fantásticos, lea el artículo de GoldBio a continuación.

Una evaluación del entorno SOC y el entorno adecuado para la reparación celular competente

Cuarta temperatura

La temperatura juega un papel clave en la transformación bacteriana, predominantemente en la transformación de células químicamente profesionales.

Por ejemplo, el paso de choque térmico para las células GoldBio DH10B con competencia química requiere un procesamiento gradual: incubación a 0 ° C para 30 adaptaciones Trafone, luego incubación a 42 ° C durante 52 segundos y de nuevo a 0 ° C durante 2 minutos. El paso incorrecto en este tipo de proceso puede afectar el resultado de la conversión.

Inmediatamente después de la transformación, las células transformadas necesitan calentarse hasta 37 ° C para prosperar. Una forma de hacerlo es utilizar una incubadora con agitación funcional. Esta incubadora también distribuye los nutrientes de manera uniforme a todas las células del medio nutritivo.

5. Selección de antibióticos

El antibiótico durante su plato afecta la cantidad de ronchas móviles que se desarrollarán en el plato después del cambio. Usar el antibiótico incorrecto para prevenir la valoración del crecimiento económico de las colonias en el plato. El simple hecho de usar el antibiótico en una concentración demasiado baja hará que las bacterias crezcan en su césped. Un césped bacteriano necesario es la aparición de bacterias en el plato, que forman una capa que incluye la fijación.

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Para asegurarse de que está usando el antibiótico correcto, pruebe el marcador seleccionable en un plásmido humano real. El marcador seleccionable suele ser otro gen de peso de antibiótico. Por ejemplo, si un plásmido de seguimiento contiene un gen de resistencia a la ampicilina, coloque ampicilina en la placa para clasificar sus células no transformadas distintivas. Por lo tanto, solo las células transformadas florecen a través de la placa.

Independientemente del antibiótico que se utilice, tenga presente que la incubación de esta tableta durante más de 16 horas ciertamente puede causar colonias satélites que crecerán.